分析myc小鼠的转基因复本和肿瘤发生
作者：陈汉源，曾位森，谢卫兵，罗琛
单位：第一军医大学细胞生物学实验室(广州510515)
关键词：转基因小鼠；myc基因；实验性肿瘤；倍体性
癌症99zk03
【摘要】目的：研究带外源myc和ras转基因小鼠的致瘤潜能和肿瘤生物学特性。方法：斑点杂交、光密度测量和Southrn印迹分析myc小鼠基因组和诱发的肿瘤DNA。肿瘤组织经过显微镜观察和免疫组织化学反应。结果：在存活一年以上的38只转基因小鼠中有12只(9myc和3myc+ras)发生多种肿瘤，其组织类型以成淋巴细胞瘤和纤维肉瘤居多。肿瘤组织含有的myc癌蛋白显著高于四周正常组织，24例myc小鼠基因组DNA含myc基因为三倍体。在3例myc小鼠肿瘤TDNA中，1例为二倍体，2例为超四倍体。结论：myc基因扩增和myc癌蛋白过量表达在转基因小鼠肿瘤发生中起重要作用。
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中图号：R73-354 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)s0-0006-04H
Analysis of transgene copies and tumor development in mice bearing myc genes
CHEN Han- yuan， ZENG Wei- sen， XIE Wei- bing, et al.
Laboratory of cell Biology,First Military Medical Universtty.Guangzhou 510515,P.R.China
【Abstract】 Objective： To investigate the tumorigenic potential and biological character of tumors in transgenic mice bearing exogenous myc and ras genes. Method： Dot hybridization,photometric determination and Southern blot were used to analyze the genomic DNA of transgenic mice and induced tumors.Microscopic observation and immunohistochemical reaction were performed to study the tumor tissues. Results： Among 38 transgenic mice surviving beyond one year.12(9 myc and 3 myc+ ras)mice developed multiple neoplasms.Most tumors were observed as lymphoblastoma and fibrosarcoma in histological types.The Myc oncoprotein in tumor tissue was significantly higher than that in surrounding normal tissue.The myc gene copies in the genome of 24 transgenic mice reached to triploid(3.16N).As for the copies of myc gene in tumor DNA,one sample maintains diploid(1.95N),two samples amplified up to hyper-tetraploid(4.21N). Conclusion： The amplification of myc genes and overexpression of Myc oncoprotein may play important role in the tumorigenesis in transgenic mice.
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Key words： Transgenic mice;Myc gene;Experimental neoplasm;Polyploid
许多人体肿瘤myc基因扩增和ras基因突变。转基因技术可能直接分析癌基因变化在诱发动物肿瘤中的作用(1)。目前认为正常细胞癌变要经过“二次击中”，需有二种以上癌基因变化，或癌基因和其他致癌因素合作。这在双重转基因小鼠中得到证实。但从二种转基因小鼠杂交产生双重转基因动物的手续复杂，时间漫长。我们实验室曾经将MMTV-H3-c-myc和MMTV-v-Ha-ras二种基因构件混合注射到受精卵中，除获得单一整合myc或ras小鼠外，尚有少量myc+ras双重转基因小鼠，既方便，又省时。本实验研究转基因小鼠的肿瘤发生和肿瘤生物学特性，分析转基因小鼠基因组和肿瘤DNA中myc基因复本数目。
1 材料和方法
转基因小鼠整合外源基因后，由于遗传不平衡和插入突变，引起代谢紊乱，免疫功能降低。因而小鼠体弱多病，易遭感染早死，尤其是双重转基因小鼠，这符合国际报导。我们应用myc和myc+ras转基因小鼠为材料，进行下列研究。
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1.1检查肿瘤发生
转基因小鼠的肿瘤大多发生在生命晚期，一般存活一、二年以后。小鼠经解剖、检查和测量肿瘤的大小，并切取肿瘤组织，固定于Carnoy(3∶1)液，石蜡切片，HE染色，显微镜观察组织学类型。
1.2免疫组织化学反应
小鼠肿瘤和对照正常组织固定于福尔马林或Carnoy液，石蜡切片。以H2O2抑制组织切片内源性过氧化物酶活性，皂角苷和柠檬酸液暴露组织中抗原。切片经抗c-myc(C-33)小鼠ⅠgG单抗(北京中山生物技术有限公司)处理后，进行ABC两用免疫组织化学检测(华美生物工程公司)，在显微镜下观察制片，比较肿瘤和对照组织的显色反应。
1.3斑点杂交〔3〕
从小鼠尾巴和肿瘤抽提DNA，测定其纯度和浓度，在尼龙膜上点样，斑点最大直径3mm，经过变性后烘烤。以H3-c-myc经过SacⅠ和XhoⅠ酶切片段为探针，经32PdCTP标记，并与尼龙膜的斑点DNA杂交。然后尼龙膜对X光软片暴光、显影和定影。并应用先进的凝胶记录系统(UVP)逐一测量斑点的光密度总量。分组如下：
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1.3.1差异DNA含量的斑点系列：在图1和表1中1、2、3、4、5、8列自上而下各6斑点分为四组。
(1)组：mycDNA阳性对照。HC-myc(14kb)购自华美生物工程公司，1列6斑点分虽含7.5，15，30，60，150，300×10-4μg，8列6斑点分别含5，10，20，40，100，200×10-4μg。
(2)组：正常小鼠NDNA对照。3列6斑点各含0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，1.2μg。
(3)组myc小鼠尾巴DNA。2列为G055DNA，5列为G121DNA，两列6斑点各含0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.4μg。
(4)组：myc小鼠肿瘤TDNA。4列淋巴瘤G121TDNA6斑点各含0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.4μg。
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1.3.2相同DNA含量的斑点系列：图1和表1中其余27斑点均含0.4μgDNA，用以检测myc小鼠尾巴和肿瘤TDNA中含有myc基因复本数目。
1.4Southern印迹分析(4)
将小鼠尾巴和肿瘤TDNA经HindⅢ和BamHⅠ酶切成片段，并以HindⅢ酶切的λDNA为分子大小标准，经过琼脂糖凝胶电泳，分离成带，再经变性后转移到尼龙膜上以，SacⅠ和XhoⅠ酶切的H3-c-myc片段为探针，经32PdCTP标记，进行了杂交和放射自显影。
表1 在放射自显影中斑点排列和myc基因倍体性
1列
2列
3列
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4列
5列
6列
7列
8列
1行
myc
G055
N
G121T
G121
G1831
, 百拇医药
G116
myc
0.61
1.18
2行
myc
G055
N
G121T
G121
G1832
G120
, http://www.100md.com
myc
3.69
3.26
3行
myc
G055
N
G121T
G121
G1833
G122
myc
, 百拇医药
2.78
2.78
4行
myc
G055
N
G121T
G121
G1835
G123T
myc
2.00
, 百拇医药
3.24
3.95
5行
myc
G055
N
G121T
G121
G1836
G124
myc
3.01
, 百拇医药
3.72
6行
myc
G055
N
G121T
G121
G18310
G125
myc
2.00
3.61
, http://www.100md.com
2.99
7行
G1361
G1362
G1363
G1364
G113T
G18311
G126
G133
3.43
, 百拇医药
2.94
3.96
3.82
4.73
3.93
2.77
3.78
8行
G1365
G1366
G13611
G1361
, 百拇医药
G1834
G130
G123T
3.28
3.65
3.50
3.40
2.78
3.84
4.02
图1myc小鼠基因组DNA和肿瘤TDNA
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斑点杂交的放射自显影
2结果
2.1肿瘤发生和组织学观察
许多转基因小鼠在肿瘤发生前病死，有些小鼠骤然暴死，未能及时检查外，存活一年以上的38只G0和G1代转基因小鼠于326-907天龄杀死，解剖检查，发现有12只小鼠发生各种不同大小肿瘤。其中myc小鼠9只，my琴+ras小鼠3只。雌性8只，雄性4只。直径3mm以上巨瘤22个，位于腹腔的最大淋巴瘤5.0cm×8.4cm×7.6cm。直径2-3mm大瘤8个，直径1-2mm中瘤15个，直径1mm以下小瘤13个。中小型肿瘤大多出现在肝和肺表层，经切片证实。由于未作连续切片，估计会有漏检。其中有5只G1代同胞小鼠中4只患瘤，似为肿瘤高发家系。在显微镜下观察肿瘤的组织学类型，出现的频率依次为成淋巴细胞瘤、纤维肉瘤、肝细胞瘤、肺实质性细胞瘤和其他。前者发生于淋巴结、胸腺和脾中，有的脾增大二三倍。纤维肉瘤出现于腹腔、腹壁和阴道壁内。
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2.2免疫组织化学反应
组织切片经免疫组化反应后，显微镜观察显示，细胞核橙黄色，细胞质浅色。经过反复对比表明，myc小鼠成淋巴细胞瘤和纤维肉瘤要比对照正常组织显色较深，小型肝瘤和肺瘤较四周正常组织反应较强(见图2)。提示肿瘤组织存在较高水平的Myc癌蛋白质，可能由于myc转基因过量表达所致。
图2肿瘤组织的免疫组织化学反应
A、中部为肝瘤，四周为正常肝组织(×500)
B、上部为肺瘤，下部为正常肺组织(×500)
2.3斑点杂交
表2详细记录测定的斑点光密度数值。总的看来，在差异DNA含量的各列斑点中，随着DNA含量的逐级递增，其光密度数值依次提高，显示斑点杂交结果的剂量和反应呈正相关。在其余相同的0.4μgDNA的27斑点中，光密度数值和myc基因复本数目相关。
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(1)0.4μg正常小鼠NDNA和mycG055小鼠DNA斑点光密度数值相近，平均为114421.92±1792.23。
(2)24只mycG1小鼠尾巴DNA斑点的光密度数值平均为179129.70±45709.74。
(3)3例mycG1小鼠肿瘤TDNA斑点的光密度值如下：
①G121♀小鼠存活564天，脾内一个淋巴肉瘤，大小为1.26cm×0.95cm×0.95cm。G121DNA为2.62N，G121TDNA为1.95N，两者均为二倍体。
②G123♂小鼠存活606天，腹腔有二个纤维肉瘤，各为2.80cm×1.95cm×1.14cm和1.29cm×0.93cm×0.59cm。G123TDNA为四倍体(3.95N和4.02N)。
③G113♂小鼠存活619天，腹腔二个淋巴肉瘤，各为2.72cm×1.69cm×0.99cm和1.04cm×0.81cm×0.55cm。G113TDNA为超四倍体(4.73N)。
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除①G121TDNA为二倍体外，②G123TDNA和③G113TDNA斑点光密度平均值为24211642±2457368，为超四体。
(4)经过t检验比较三项光密度平均值：(1)和(2)项差异显著(P<0.05),提示myc G1小鼠尾巴内myc DNA含量要高于正常小鼠基因组内myc DNA.(1)和(3)项差异非常显著(P<0.01),显示myc G1小鼠肿瘤内myc DNA含量明显高于正常小鼠基因组内myc DNA。(2)和(3)项差异非常显著(P〈0.01),表明myc G1小鼠中,肿瘤内myc DNA含量明显高于尾巴内myc DNA。正常小鼠基因组售有2复本myc原癌基因，为二倍休。以些为比较标准，依据刘量和瓜的正相关，从相同剂量的DNA班占领光密度总是求得所含的myc基因复本数目或倍体性。表1详列相同0.4μDNA所含的myc基因倍体性。其中24只myc G1小鼠尾以DAN平均基因倍体性3.16N。是三倍体(1.95N)。在例小鼠肿瘤中，例为二倍体力劳动例为超四倍体(4.32N)。
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表2 在放射自显影中斑点的光密度数值
1列
2列
3列
4列
5列
6列
7列(i)
8列
1行
26551.07
9139.73
27817.60
, 百拇医药
19427.80
15281.93
34925.07
67256.01
2行
25899.87
24098.21
39434.14
29401.13
43913.53
210860.08
186731.82
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3行
32470.67
28938.87
74335.01
79502.72
60427.74
158968.20
159210.56
36328.07
4行
84103.09
53407.68
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113154.62
105806.47
96344.61
185441.93
225863.20
67279.06
5行
105157.41
71251.06
125923.88
130593.86
139332.03
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172475.53
212582.13
90752.00
6行
193022.79
115689.21
175655.37
112036.21
150037.40
206266.72
170878.34
167516.19
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7行
196022.32
168318.48
198149.96
218548.98
270386.02
244994.41
158567.08
216107.07
8行
187935.49
208631.05
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200089.08
194286.23
141981.29
219885.00
230100.00
图3myc小鼠基因组DNA和肿瘤DNA经Southern印迹的放射自显影。凝胶2，5，6分别为G1834，G123T和G121TDNA，其6.7kb电泳带与标记探针杂交。凝胶1、3为myc负反应DNA，无电泳带。凝胶4为正常鼠DNA对照，凝胶7为λDNA分子标准。
2.4Southem印迹分析
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在图3放射自显影中，凝胶2为myc小鼠G1834DNA，5为肿瘤G123TDNA，6为G121TDNA。经酶切和电泳后，所分离的6.7kbDNA片段与标记探针杂交，凝胶4为正常小鼠DNA则否，证明myc小鼠基因组和肿瘤中整合有myc转基因复本。
3讨论
过去学者曾经构建多种融合基因构件，应用转基因技术分析外源myc和ras基因对动物的致瘤潜能和作用原理(5～11)。我们曾经建成携带myc、ras和myc+ras转基因小鼠，高频率地发生多种不同肿瘤。检测表明转基因小鼠基因组中，myc基因扩增到三倍体，肿瘤的myc基因扩增到超四倍体，而且过量表达myc癌蛋白质。推测这在转基因小鼠的高发肿瘤中起重要作用。近年来肿瘤生物学研究表明，细胞的恶性转化由于多种肿瘤基因突变的连续积累引起(12)。原来正常细胞具有防护系统，能够限制刺激生长因子，或产生抵抗增殖因子，防止细胞过度增殖。原癌基因突变成为细胞癌基因后，表达过分激活的癌蛋白质，促使细胞持续分裂。抑癌基因缺失或失活后，不能阻止细胞的不正常生长。这些基因变化均能诱导细胞凋亡，由此消灭祸源。偶尔逃避凋亡的变异细胞的分裂周期错乱失控，能够无限制地生长分裂，逐步演发成为肿瘤。正常细胞经过分裂原和生长因子诱导后，激活myc原癌基因，所编码的myc癌蛋白质能与专一的DNA顺序结合，成为核内转录因子，激活有关控制细胞分裂的基因表达，形成高水平的myc癌蛋白质。在人巴基特淋巴瘤和小鼠浆细胞瘤中，经过染色体易位，使myc基因受到免疫球蛋白增强子和启动子的强烈激活，过量表达myc癌蛋白质。这些事例说明过高水平的myc癌蛋白质是细胞癌变的重要诱因(13，14)。
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基金项目：本课题承受全军医药卫生科研基金(1594)、广东省自然科学基金(920193)和国家自然科学基金(39200143)资助。
〔参考文献〕
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2 陈汉源.陆荣华，余焱林等.myc和ras癌基因共整合转基因小鼠的建立〔J〕.第一军医大学学报，1998，18：52.
3 陈汉源，邹志华，杜世玲.大肠癌中myc基因扩增的追溯分析〔J〕.第一军医大学学报，1992，12：253.
4 萨姆布鲁丁J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯J.分子克隆实验指南〔M〕.第二版.北京：科学出版社，1993：474.
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5 Sidman CL,Denial TW,Marshall JD,et al.Multiple mechanism of tumorigenesis in Eu myc transgenic mice〔J〕 .Cancer Res,1991,53:1665.
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7 Sinn E,Muller M,Pattengale P,et al.Coexpression of MMTV/v-Ha-ras and MMTV/c-myc genes in transgenic mice.Synergistic action of oncogenes in vivo.Cell,1987,49:465.
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8 Spanopoulou E， Early E,Elliott J,et al.Complx lymphoid and epithelial thymus tumors in thyl-myc transgenic mice〔J〕 .Nature,1989,342:185.
9 Stewart M,Cameron E,Cambell M,et al.Conditional expression and oncogenecity of c myc linked to a CD2 gene dominant control region.Int 〔J〕 .Cancer,1993,53:1023.
10 Cameron ER,Campbrll M,Blyth K,et al.Apparent bypass of negative selection in CD8+ tumor in CD2-myc transgenic mice〔J〕.Brit J Cancer,1996,73:13.
, 百拇医药
11 Velster G,Dnions DE,Neil JC,et al.Skewed T cell receptor V β 8-2 expression in transgenic CD2-myc induced thymus lymphoma.A role for antigen stimulation in tumor development〔J〕.Brit J Cancer,1997,76:739.
12 Cavenee WK,White RL.The genetic basis of cancer.〔J〕 Scientific Amerrican,1995,272(3):72.
13 Weiberg RA,How cancer arises.Scientific〔J〕.American,1996,275:32.
14 Desbarats L,Schneider A,Muller D,et al.Myc:a simple gene controls both proliferation and apoptosis in mammalian cells〔J〕. Experientia,1996,52:1123.
收稿日期：1998-09-22；修回日期：1998-11-10, http://www.100md.com
单位：第一军医大学细胞生物学实验室(广州510515)
关键词：转基因小鼠；myc基因；实验性肿瘤；倍体性
癌症99zk03
【摘要】目的：研究带外源myc和ras转基因小鼠的致瘤潜能和肿瘤生物学特性。方法：斑点杂交、光密度测量和Southrn印迹分析myc小鼠基因组和诱发的肿瘤DNA。肿瘤组织经过显微镜观察和免疫组织化学反应。结果：在存活一年以上的38只转基因小鼠中有12只(9myc和3myc+ras)发生多种肿瘤，其组织类型以成淋巴细胞瘤和纤维肉瘤居多。肿瘤组织含有的myc癌蛋白显著高于四周正常组织，24例myc小鼠基因组DNA含myc基因为三倍体。在3例myc小鼠肿瘤TDNA中，1例为二倍体，2例为超四倍体。结论：myc基因扩增和myc癌蛋白过量表达在转基因小鼠肿瘤发生中起重要作用。
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中图号：R73-354 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)s0-0006-04H
Analysis of transgene copies and tumor development in mice bearing myc genes
CHEN Han- yuan， ZENG Wei- sen， XIE Wei- bing, et al.
Laboratory of cell Biology,First Military Medical Universtty.Guangzhou 510515,P.R.China
【Abstract】 Objective： To investigate the tumorigenic potential and biological character of tumors in transgenic mice bearing exogenous myc and ras genes. Method： Dot hybridization,photometric determination and Southern blot were used to analyze the genomic DNA of transgenic mice and induced tumors.Microscopic observation and immunohistochemical reaction were performed to study the tumor tissues. Results： Among 38 transgenic mice surviving beyond one year.12(9 myc and 3 myc+ ras)mice developed multiple neoplasms.Most tumors were observed as lymphoblastoma and fibrosarcoma in histological types.The Myc oncoprotein in tumor tissue was significantly higher than that in surrounding normal tissue.The myc gene copies in the genome of 24 transgenic mice reached to triploid(3.16N).As for the copies of myc gene in tumor DNA,one sample maintains diploid(1.95N),two samples amplified up to hyper-tetraploid(4.21N). Conclusion： The amplification of myc genes and overexpression of Myc oncoprotein may play important role in the tumorigenesis in transgenic mice.
, 百拇医药
Key words： Transgenic mice;Myc gene;Experimental neoplasm;Polyploid
许多人体肿瘤myc基因扩增和ras基因突变。转基因技术可能直接分析癌基因变化在诱发动物肿瘤中的作用(1)。目前认为正常细胞癌变要经过“二次击中”，需有二种以上癌基因变化，或癌基因和其他致癌因素合作。这在双重转基因小鼠中得到证实。但从二种转基因小鼠杂交产生双重转基因动物的手续复杂，时间漫长。我们实验室曾经将MMTV-H3-c-myc和MMTV-v-Ha-ras二种基因构件混合注射到受精卵中，除获得单一整合myc或ras小鼠外，尚有少量myc+ras双重转基因小鼠，既方便，又省时。本实验研究转基因小鼠的肿瘤发生和肿瘤生物学特性，分析转基因小鼠基因组和肿瘤DNA中myc基因复本数目。
1 材料和方法
转基因小鼠整合外源基因后，由于遗传不平衡和插入突变，引起代谢紊乱，免疫功能降低。因而小鼠体弱多病，易遭感染早死，尤其是双重转基因小鼠，这符合国际报导。我们应用myc和myc+ras转基因小鼠为材料，进行下列研究。
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1.1检查肿瘤发生
转基因小鼠的肿瘤大多发生在生命晚期，一般存活一、二年以后。小鼠经解剖、检查和测量肿瘤的大小，并切取肿瘤组织，固定于Carnoy(3∶1)液，石蜡切片，HE染色，显微镜观察组织学类型。
1.2免疫组织化学反应
小鼠肿瘤和对照正常组织固定于福尔马林或Carnoy液，石蜡切片。以H2O2抑制组织切片内源性过氧化物酶活性，皂角苷和柠檬酸液暴露组织中抗原。切片经抗c-myc(C-33)小鼠ⅠgG单抗(北京中山生物技术有限公司)处理后，进行ABC两用免疫组织化学检测(华美生物工程公司)，在显微镜下观察制片，比较肿瘤和对照组织的显色反应。
1.3斑点杂交〔3〕
从小鼠尾巴和肿瘤抽提DNA，测定其纯度和浓度，在尼龙膜上点样，斑点最大直径3mm，经过变性后烘烤。以H3-c-myc经过SacⅠ和XhoⅠ酶切片段为探针，经32PdCTP标记，并与尼龙膜的斑点DNA杂交。然后尼龙膜对X光软片暴光、显影和定影。并应用先进的凝胶记录系统(UVP)逐一测量斑点的光密度总量。分组如下：
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1.3.1差异DNA含量的斑点系列：在图1和表1中1、2、3、4、5、8列自上而下各6斑点分为四组。
(1)组：mycDNA阳性对照。HC-myc(14kb)购自华美生物工程公司，1列6斑点分虽含7.5，15，30，60，150，300×10-4μg，8列6斑点分别含5，10，20，40，100，200×10-4μg。
(2)组：正常小鼠NDNA对照。3列6斑点各含0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，1.2μg。
(3)组myc小鼠尾巴DNA。2列为G055DNA，5列为G121DNA，两列6斑点各含0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.4μg。
(4)组：myc小鼠肿瘤TDNA。4列淋巴瘤G121TDNA6斑点各含0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.4μg。
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1.3.2相同DNA含量的斑点系列：图1和表1中其余27斑点均含0.4μgDNA，用以检测myc小鼠尾巴和肿瘤TDNA中含有myc基因复本数目。
1.4Southern印迹分析(4)
将小鼠尾巴和肿瘤TDNA经HindⅢ和BamHⅠ酶切成片段，并以HindⅢ酶切的λDNA为分子大小标准，经过琼脂糖凝胶电泳，分离成带，再经变性后转移到尼龙膜上以，SacⅠ和XhoⅠ酶切的H3-c-myc片段为探针，经32PdCTP标记，进行了杂交和放射自显影。
表1 在放射自显影中斑点排列和myc基因倍体性
1列
2列
3列
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4列
5列
6列
7列
8列
1行
myc
G055
N
G121T
G121
G1831
, 百拇医药
G116
myc
0.61
1.18
2行
myc
G055
N
G121T
G121
G1832
G120
, http://www.100md.com
myc
3.69
3.26
3行
myc
G055
N
G121T
G121
G1833
G122
myc
, 百拇医药
2.78
2.78
4行
myc
G055
N
G121T
G121
G1835
G123T
myc
2.00
, 百拇医药
3.24
3.95
5行
myc
G055
N
G121T
G121
G1836
G124
myc
3.01
, 百拇医药
3.72
6行
myc
G055
N
G121T
G121
G18310
G125
myc
2.00
3.61
, http://www.100md.com
2.99
7行
G1361
G1362
G1363
G1364
G113T
G18311
G126
G133
3.43
, 百拇医药
2.94
3.96
3.82
4.73
3.93
2.77
3.78
8行
G1365
G1366
G13611
G1361
, 百拇医药
G1834
G130
G123T
3.28
3.65
3.50
3.40
2.78
3.84
4.02
图1myc小鼠基因组DNA和肿瘤TDNA
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斑点杂交的放射自显影
2结果
2.1肿瘤发生和组织学观察
许多转基因小鼠在肿瘤发生前病死，有些小鼠骤然暴死，未能及时检查外，存活一年以上的38只G0和G1代转基因小鼠于326-907天龄杀死，解剖检查，发现有12只小鼠发生各种不同大小肿瘤。其中myc小鼠9只，my琴+ras小鼠3只。雌性8只，雄性4只。直径3mm以上巨瘤22个，位于腹腔的最大淋巴瘤5.0cm×8.4cm×7.6cm。直径2-3mm大瘤8个，直径1-2mm中瘤15个，直径1mm以下小瘤13个。中小型肿瘤大多出现在肝和肺表层，经切片证实。由于未作连续切片，估计会有漏检。其中有5只G1代同胞小鼠中4只患瘤，似为肿瘤高发家系。在显微镜下观察肿瘤的组织学类型，出现的频率依次为成淋巴细胞瘤、纤维肉瘤、肝细胞瘤、肺实质性细胞瘤和其他。前者发生于淋巴结、胸腺和脾中，有的脾增大二三倍。纤维肉瘤出现于腹腔、腹壁和阴道壁内。
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2.2免疫组织化学反应
组织切片经免疫组化反应后，显微镜观察显示，细胞核橙黄色，细胞质浅色。经过反复对比表明，myc小鼠成淋巴细胞瘤和纤维肉瘤要比对照正常组织显色较深，小型肝瘤和肺瘤较四周正常组织反应较强(见图2)。提示肿瘤组织存在较高水平的Myc癌蛋白质，可能由于myc转基因过量表达所致。
图2肿瘤组织的免疫组织化学反应
A、中部为肝瘤，四周为正常肝组织(×500)
B、上部为肺瘤，下部为正常肺组织(×500)
2.3斑点杂交
表2详细记录测定的斑点光密度数值。总的看来，在差异DNA含量的各列斑点中，随着DNA含量的逐级递增，其光密度数值依次提高，显示斑点杂交结果的剂量和反应呈正相关。在其余相同的0.4μgDNA的27斑点中，光密度数值和myc基因复本数目相关。
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(1)0.4μg正常小鼠NDNA和mycG055小鼠DNA斑点光密度数值相近，平均为114421.92±1792.23。
(2)24只mycG1小鼠尾巴DNA斑点的光密度数值平均为179129.70±45709.74。
(3)3例mycG1小鼠肿瘤TDNA斑点的光密度值如下：
①G121♀小鼠存活564天，脾内一个淋巴肉瘤，大小为1.26cm×0.95cm×0.95cm。G121DNA为2.62N，G121TDNA为1.95N，两者均为二倍体。
②G123♂小鼠存活606天，腹腔有二个纤维肉瘤，各为2.80cm×1.95cm×1.14cm和1.29cm×0.93cm×0.59cm。G123TDNA为四倍体(3.95N和4.02N)。
③G113♂小鼠存活619天，腹腔二个淋巴肉瘤，各为2.72cm×1.69cm×0.99cm和1.04cm×0.81cm×0.55cm。G113TDNA为超四倍体(4.73N)。
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除①G121TDNA为二倍体外，②G123TDNA和③G113TDNA斑点光密度平均值为24211642±2457368，为超四体。
(4)经过t检验比较三项光密度平均值：(1)和(2)项差异显著(P<0.05),提示myc G1小鼠尾巴内myc DNA含量要高于正常小鼠基因组内myc DNA.(1)和(3)项差异非常显著(P<0.01),显示myc G1小鼠肿瘤内myc DNA含量明显高于正常小鼠基因组内myc DNA。(2)和(3)项差异非常显著(P〈0.01),表明myc G1小鼠中,肿瘤内myc DNA含量明显高于尾巴内myc DNA。正常小鼠基因组售有2复本myc原癌基因，为二倍休。以些为比较标准，依据刘量和瓜的正相关，从相同剂量的DNA班占领光密度总是求得所含的myc基因复本数目或倍体性。表1详列相同0.4μDNA所含的myc基因倍体性。其中24只myc G1小鼠尾以DAN平均基因倍体性3.16N。是三倍体(1.95N)。在例小鼠肿瘤中，例为二倍体力劳动例为超四倍体(4.32N)。
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表2 在放射自显影中斑点的光密度数值
1列
2列
3列
4列
5列
6列
7列(i)
8列
1行
26551.07
9139.73
27817.60
, 百拇医药
19427.80
15281.93
34925.07
67256.01
2行
25899.87
24098.21
39434.14
29401.13
43913.53
210860.08
186731.82
, http://www.100md.com
3行
32470.67
28938.87
74335.01
79502.72
60427.74
158968.20
159210.56
36328.07
4行
84103.09
53407.68
, http://www.100md.com
113154.62
105806.47
96344.61
185441.93
225863.20
67279.06
5行
105157.41
71251.06
125923.88
130593.86
139332.03
, http://www.100md.com
172475.53
212582.13
90752.00
6行
193022.79
115689.21
175655.37
112036.21
150037.40
206266.72
170878.34
167516.19
, 百拇医药
7行
196022.32
168318.48
198149.96
218548.98
270386.02
244994.41
158567.08
216107.07
8行
187935.49
208631.05
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200089.08
194286.23
141981.29
219885.00
230100.00
图3myc小鼠基因组DNA和肿瘤DNA经Southern印迹的放射自显影。凝胶2，5，6分别为G1834，G123T和G121TDNA，其6.7kb电泳带与标记探针杂交。凝胶1、3为myc负反应DNA，无电泳带。凝胶4为正常鼠DNA对照，凝胶7为λDNA分子标准。
2.4Southem印迹分析
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在图3放射自显影中，凝胶2为myc小鼠G1834DNA，5为肿瘤G123TDNA，6为G121TDNA。经酶切和电泳后，所分离的6.7kbDNA片段与标记探针杂交，凝胶4为正常小鼠DNA则否，证明myc小鼠基因组和肿瘤中整合有myc转基因复本。
3讨论
过去学者曾经构建多种融合基因构件，应用转基因技术分析外源myc和ras基因对动物的致瘤潜能和作用原理(5～11)。我们曾经建成携带myc、ras和myc+ras转基因小鼠，高频率地发生多种不同肿瘤。检测表明转基因小鼠基因组中，myc基因扩增到三倍体，肿瘤的myc基因扩增到超四倍体，而且过量表达myc癌蛋白质。推测这在转基因小鼠的高发肿瘤中起重要作用。近年来肿瘤生物学研究表明，细胞的恶性转化由于多种肿瘤基因突变的连续积累引起(12)。原来正常细胞具有防护系统，能够限制刺激生长因子，或产生抵抗增殖因子，防止细胞过度增殖。原癌基因突变成为细胞癌基因后，表达过分激活的癌蛋白质，促使细胞持续分裂。抑癌基因缺失或失活后，不能阻止细胞的不正常生长。这些基因变化均能诱导细胞凋亡，由此消灭祸源。偶尔逃避凋亡的变异细胞的分裂周期错乱失控，能够无限制地生长分裂，逐步演发成为肿瘤。正常细胞经过分裂原和生长因子诱导后，激活myc原癌基因，所编码的myc癌蛋白质能与专一的DNA顺序结合，成为核内转录因子，激活有关控制细胞分裂的基因表达，形成高水平的myc癌蛋白质。在人巴基特淋巴瘤和小鼠浆细胞瘤中，经过染色体易位，使myc基因受到免疫球蛋白增强子和启动子的强烈激活，过量表达myc癌蛋白质。这些事例说明过高水平的myc癌蛋白质是细胞癌变的重要诱因(13，14)。
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基金项目：本课题承受全军医药卫生科研基金(1594)、广东省自然科学基金(920193)和国家自然科学基金(39200143)资助。
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收稿日期：1998-09-22；修回日期：1998-11-10, http://www.100md.com